Γεννήθηκε στα Λύστρα της Λυκαονίας από πατέρα Έλληνα και μητέρα Ιουδαία, την Ευνίκη, και έζησε στα χρόνια του αυτοκράτορα Δομιτιανού. Έμεινε από πολύ μικρός ορφανός από πατέρα και η γιαγιά του, η Λωίδα, τον ανέθρεψε εν παιδεία και νουθεσία Κυρίου. Όταν ο απόστολος Παύλος επισκέφθηκε τα Λύστρα, εκτιμώντας τα πνευματικά του χαρίσματα και τον φλογερό ιεραποστολικό του ζήλο, τον διαπαιδαγώγησε κατάλληλα και τον πήρε συνοδό του στη 2η αποστολική περιοδεία, κατά την οποία ο Τιμόθεος έζησε όλες τις περιπέτειες του κορυφαίου Αποστόλου για τη διάδοση του μηνύματος του Ευαγγελίου. Έμεινε ακλόνητος απέναντι στους εκτρεπομένους από την ορθή πίστη και τους αιρετικούς. Μετά τον μαρτυρικό θάνατο του Παύλου επέστρεψε στην Έφεσο και συνέχισε την ιεραποστολική του δράση. Διετέλεσε επίσκοπος Εφέσου, όπου έπεσε θύμα της οργής των ειδωλολατρών, ενώ προσπαθούσε να αποτρέψει τα ατοπήματά τους. Κατά τη διάρκεια μιας ειδωλολατρικής γιορτής της Εφέσιας Αρτέμιδος υπέστη άγριο ξυλοδαρμό και μαρτυρικό θάνατο από χτυπήματα ροπάλων του εξαγριωμένου όχλου των ειδωλολατρών. Το σκήνωμά του μεταφέρθηκε τον 4ο αιώνα μ.Χ. στην Κωνσταντινούπολη, στον ναό των Αγίων Αποστόλων.